Starter culture e estocagem de leveduras

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Trabalhando com leveduras em um laboratório de microbiologia, aprendi duas lições fundamentais (como princípio, mas principalmente com o tempo): a importância do armazenamento dos microrganismos com os quais eu trabalho e como uma correta estocagem é crucial para que se possa fazer um bom trabalho. Na produção de cervejas, a propagação das leveduras interfere na fermentação e essa, por sua vez, está diretamente relacionada ao processo de armazenamento e no manejo das leveduras. Manter culturas estáveis e puras de leveduras auxilia na produção de uma cerveja de qualidade consistente e é de grande valia para o sucesso da produção da mesma. Um bom armazenamento para a produção de cervejas, em larga ou pequena escala, precisa garantir que as leveduras possam ser estocadas por longos períodos de tempo, da forma mais simples e acessível possível, mantendo-as estáveis genética e fenotipicamente, além de garantir a viabilidade celular. Em laboratório, algumas técnicas como cultura em meios sólidos, em caldo, liofilização e armazenamento com nitrogênio líquido são comumente utilizadas. Cada uma dessas técnicas têm vantagens e desvantagens, sendo preciso avaliar suas prioridades na hora de escolher como armazenar suas leveduras. Sempre é possível, é claro, comprar estoques prontos. Mas e se você, que produz sua cerveja artesanalmente, quiser manter um estoque de leveduras para a sua produção, é possível? Como pode ser feito sem os materiais de um laboratório de microbiologia e pessoal treinado?
Se você compra culturas de leveduras prontas, já deve ter escutado o termo “starter culture”. Ao realizar os procedimentos necessários, essa técnica permite uma propagação limpa das leveduras e é muito usada por cervejeiros artesanais para a otimização da fermentação. Dessa forma, é possível garantir um maior número de células viáveis para a sua fermentação. Assim, se você compra leveduras (que não sejam secas!), você começa com um número X de células (geralmente 100 bilhões por pacote, dependendo da marca), o que nem sempre é o necessário para o seu preparo. O número de células depende da gravidade desejada do mosto, do volume final desejado, da viabilidade das células que você possui, e tudo isso interfere na quantidade de pacotes de leveduras que você geralmente usa. Assim, uma starter culture é uma ótima forma de economizar e pode ser feita em casa.
Para começar, você deve calcular o número de células necessárias para o seu preparo. Muitos livros podem auxiliar nesse cálculo, mas ferramentas online como o Yeast Pitch Rate and Starter Calculator (https://www.brewersfriend.com/yeast-pitch-rate-and-starter-calculator/) fornecem a quantidade de células necessárias conforme a OG e o volume informados, calcula a viabilidade celular através da data de fabricação e fornece os dados necessários para que você faça o starter de maneira adequada.

Com os resultados dos cálculos em mãos, você já pode iniciar a produção do starter!
Fazer uma starter culture é similar a fazer um mini-batch, e é possível de ser feito com os materiais que você possui em casa.
Materiais necessários:

• Erlenmeyer ou Frasco de Vidro: Um frasco de vidro ou um erlenmeyer (geralmente de 1 a 2 litros) é ideal para preparar e fermentar o starter. Ele deve ser grande o suficiente para permitir a expansão do mosto e evitar derramamentos durante a fermentação. Se você não possui um erlenmeyer, pode preparar o mosto em um recipiente limpo e que possa ser aquecido. Além disso, é importante que ele seja grande o suficiente e possa ser tapado.
• Mosto para Starter: O mosto pode ser feito em casa utilizando malte seco (DME - Dry Malt Extract) dissolvido em água. Segundo o livro “ Levedura: guia prático para a fermentação de cerveja” a razão normalmente usada é de 10:1. A calculadora anteriormente apresentada fornece o volume exato a ser usado.
• Nutriente para leveduras: Para que as leveduras apresentem crescimento, é necessário adição de nutriente para leveduras, facilmente encontrado em sites especializados. O livro “ Levedura: guia prático para a fermentação de cerveja” indica ⅛ de colher de chá, mas alguns sites apontam que ½ colher de chá é o adequado. Essa quantidade, entretanto, é variável, pois depende do volume a ser produzido.
• Fonte de Calor (Fogão ou Micro-ondas)
• Termômetro de Cozinha
• Tampa ou Papel Alumínio: Usado para cobrir o frasco durante a fermentação, permitindo a troca de gases, mas impedindo a entrada de contaminantes.
• Agitador Magnético (opcional): pode ser encontrado por valores não muito altos na internet, mas você pode fazer o seu próprio agitadores seguindo alguns tutoriais (exemplo disponível em:https://www.homebrewersassociation.org/how-to-brew/homebrew-diy-making-a-stir-plate/)
• Álcoool 70%
• Levedura Líquida ou Sólida: Pode ser levedura líquida comprada ou levedura reciclada de uma fermentação anterior.
• Colher ou Espátula Esterilizada
• Balança;
• Água.

Como fazer a starter culture:

• Para fazer a starter culture você deve, inicialmente, pesar o DME e colocá-lo no recipiente escolhido. Panelas de pressão podem ser utilizadas para um mosto estéril, mas o mais indicado é usar erlenmeyers, que podem ser colocados diretamente no fogo.
• Após isso, é feita a adição de água e do nutriente de leveduras. O recipiente deve ser grande o suficiente para o volume desejado do mosto e ter uma sobra, para que não haja vazamento. Todo o procedimento deve ser feito em um ambiente higienizado e o mais estéril possível, de preferência fechado e sem poeira. A panela, assim que adicionados os ingredientes, deve ser fechada e aberta apenas quando necessário.
• Ferva a mistura por 15 minutos e, em seguida, desligue o fogo. Após o resfriamento, se a mistura foi feita em uma panela, transfira-a para um novo recipiente. Se foi feita em um erlenmeyer, a levedura pode ser adicionada diretamente. A temperatura do starter deve ser mantida, geralmente, entre 18 e 24°C. Cubra o recipiente com alumínio ou uma rolha de tecido, permitindo a aeração. A temperatura da starter culture deve ser mantida entre 18 e 24°C.
• Nesse passo, é importante a presença de oxigênio para o crescimento celular adequado, sendo indicado que haja agitação. Pode ser usado um shaker (normalmente encontrado em laboratórios, você provavelmente não tem um), agitador magnético, que pode ser construído em casa ou encontrado por valores razoáveis, ou, também, pode ser feita a agitação manual. As leveduras, então, devem ser mantidas incubadas por cerca de 24-36 horas, sob agitação contínua ou periódica, e, assim, sua starter culture estará pronta!

Mas e o armazenamento das leveduras, que falamos lá no início? No laboratório que trabalho, uma técnica comumente utilizada é a técnica de Castellani (armazenar um recorte do meio de cultura com água em tubo de vidro vedado). Esse tipo de estocagem tem capacidade de duração de cerca de seis meses. Com o auxílio de alguns materiais que você tem em casa e alguns itens de laboratório, com valores acessíveis e facilmente encontrados na Internet, você pode manter esse tipo de estoque para as suas leveduras.
Material necessário:

• Frascos de vidro que possam ser aquecidos e esterilizados;
• Panela de pressão;
• Material que sirva de suporte para os frascos na panela de pressão;
• Água destilada;
• Placas de Petri com as leveduras ou slants;
• Alças para inóculo (descartáveis ou reutilizáveis);
• Lamparina;
• Álcool 70%;
• Ágar;
• Meio com levedura para o inóculo ou placas de cultivo feitas anteriormente;
• Erlenmeyers;
• Parafilme;
• Mosto.

Para realizar essa técnica, você precisará:

• Para fazer o meio de cultivo sólido, misture 1,5% de ágar, que pode ser encontrado na Internet ou em lojas de produtos asiáticos, ao mosto. Aqueça a mistura em uma panela, mexendo até que o ágar esteja completamente dissolvido. A quantidade de meio a ser preparada depende do número de placas ou slants que você deseja fazer. Depois de misturar, o meio deve ser esterilizado. Coloque a mistura em um frasco entreaberto ou diretamente nos frascos pequenos de vidro que serão usados para os slants (também entreabertos e posicionados em um suporte que não derreta na panela) e esterilize em uma panela de pressão por 15 minutos, na pressão máxima. Após a esterilização, se for fazer slants, incline os frascos no ângulo desejado e feche-os até o meio solidificar. Para fazer placas de Petri, o processo requer mais cuidado. Se estiver usando placas de plástico estéreis, manuseie-as cuidadosamente para mantê-las fechadas até o momento de uso. Em um ambiente com superfícies previamente limpas com álcool 70%, coloque as placas fechadas ao lado de uma lamparina acesa, para ajudar a manter a esterilidade. Abra o frasco com o meio, flambe a borda do frasco, e, abrindo a placa o mínimo possível, derrame o meio na placa, fechando-a o mais rápido possível. Deixe o meio solidificar com a placa fechada. Em ambos os casos, seja placa ou slant, inocule o meio com uma alça estéril. Se a alça for reutilizável, aqueça-a na lamparina até ficar incandescente e aguarde que esfrie antes de colocá-la em contato com a levedura. Incube as placas ou frascos em temperatura próxima a 28°C até que o crescimento das colônias atinja os níveis desejados. Realizar esse procedimento sem o uso de um fluxo laminar pode ser complicado, então observe cuidadosamente as colônias para detectar possíveis contaminações.
• Com as placas prontas, o segundo passo é esterilizar a água destilada. O procedimento é similar ao feito com os frascos com meio. Em frascos de volume menor (entre 10 e 15 mL), preencha um terço do volume do frasco com água destilada e deixe a tampa entreaberta. Com o auxílio de um suporte, coloque os mesmos na panela de pressão e os deixe na pressão máxima por 15 minutos. Desligue a panela, feche-os e espere esfriar. Seguindo as mesmas recomendações já citadas anteriormente, com a lamparina ligada, corte um pedaço do ágar da placa ou do slant com o auxílio de uma alça estéril e os coloque no frasco com água estéril. Não se esqueça de flambar a borda dos frascos. Após fechar o frasco, passe parafilme na tampa e agite o mesmo. Ele pode ser guardado por seis meses em local seco e abrigado da luz.

O outro método de armazenamento, descrito a seguir, garante maior viabilidade celular e maior duração do estoque. Nesse método, as leveduras são congeladas lentamente, usando um criopreservante (a glicerina), sem o uso de nitrogênio líquido e mantidas no freezer.
Você vai precisar de:

• Glicerina;
• Água;
• Panela de pressão;
• Frasco com tampa que pode ser aquecido e ir na panela de pressão;
• Tubos de plástico;
• Álcool 70%;
• Álcool isopropílico;
• Starter culture.

Para fazer o estoque:

• Para fazer esse estoque, você deve ter uma starter culture pronta. Deixe-a reservada decantando enquanto faz o resto dos procedimentos. Limpe as superfícies com álcool.
• Em um frasco, faça uma mistura de 50/50 de água e glicerina. Homogenize bem e coloque-a, entreaberta, em uma panela de pressão e deixe em pressão máxima por 15 minutos. Desligue a panela, feche o frasco e deixe esfriar.
• Ligue a lamparina e manuseie os tubos de plástico próximo ao fogo. Coloque meio volume de glicerina 50% e retire o líquido da starter culture, deixando apenas as leveduras decantadas, preenchendo o restante do volume do tubo de plástico com essa levedura. A concentração final do crioprotetor, que serve para que não haja formação de cristais de gelo e rompimento das células, deve ser de 25%.
• Coloque os tubos em um recipiente preenchido com álcool isopropílico e deixe no freezer por 24 horas. Isso deve fazer com que o congelamento seja mais lento, diminuindo problemas relacionados à viabilidade celular. Posterior a isso, você pode retirar o álcool e guardar os tubos diretamente no freezer.

Espero que esse breve texto ajude você no armazenamento e manejo das duas leveduras na produção de cerveja artesanal.